A simple vista parece una muestra pictórica, tal vez una recreación artística de un ecosistema marino. Pero no. Es el mundo de las células del cuerpo humano, que habitan en aparente orden y colorido. Presentación que cautiva a científicos, como Wanda Kukulski, que expresa su encantamiento por los descubrimientos a través de la llamada tomografía crioelectrónica (crio-ET). Esta técnica de microscopía permite a los investigadores hurgar en el interior de las células y ver sus proteínas en alta resolución.
Estos hallazgos son recogidos por videos. En ellos, Kukulski pudo ver cosas sorprendentes, como el funcionamiento interno de las celdas y los compartimentos dentro de estas, con detalles sin precedentes. “Estaba abrumada por su belleza y complejidad. En las noches los veía como si fuera un documental”, recuerda la bioquímica de la Universidad de Berna, Suiza y del LMB (Laboratory of Molecular Biology).
En los últimos años, las técnicas de obtención de imágenes como la crio-ET han comenzado a permitir a los científicos ver moléculas biológicas en sus entornos nativos. A diferencia de los métodos más antiguos que sacan proteínas individuales de sus nichos para estudiarla. Estas técnicas brindan una visión holística de las proteínas y otras moléculas junto con el paisaje celular. Aunque todavía tienen limitaciones. Algunos investigadores dicen que la resolución de la crio-ET, por ejemplo, es demasiado baja para que las moléculas se puedan identificar con certeza. Las técnicas están aumentando en popularidad y sofisticación.
Los investigadores que recurren a ellos no solo quedan hipnotizados por las hermosas imágenes, sino también por algunos de los secretos que se están revelando. Como los trucos que usan las bacterias para infectar células o cómo las proteínas mutadas impulsan enfermedades neurodegenerativas como el Parkinson, reseña un estudio publicado en Nature.
Técnicas de microscopía en células
Cada mirada a través del microscopio es otra oportunidad de adentrarse a un terreno celular inexplorado, dice Grant Jensen, biólogo estructural del Instituto de Tecnología de California en Pasadena. «Definitivamente es una gran alegría poder ver algo por primera vez», dice.
Otros investigadores comparten su alegría, como Elizabeth Villa, biofísica de la Universidad de California en San Diego. “Sentí como si, de repente, fuéramos paparazzi con un acceso que nunca antes habíamos tenido”.
Durante décadas, los investigadores se han basado en una técnica llamada cristalografía de rayos X para visualizar proteínas, virus y otras entidades biológicas. El método implica persuadir a las moléculas para que formen cristales estáticos y bien ordenados y luego bombardear las muestras con intensos rayos X. Permitió descubrir la naturaleza helicoidal del ADN y la estructura de más de 100.000 proteínas. Pero tiene sus limitaciones: cristalizar moléculas es difícil y tedioso, y no siempre es posible.
Los científicos han superado estos inconvenientes utilizando microscopía crioelectrónica (crio-EM). Un sistema que revela la estructura de biomoléculas que han sido aisladas de su entorno y luego congeladas. En crio-EM, las muestras se bañan con haces de electrones. La técnica fue inicialmente ridiculizada como ‘blobología’, debido a las imágenes borrosas que producía. Los avances en la preparación de muestras y el procesamiento de imágenes han aumentado su resolución lo suficiente como para visualizar átomos individuales. Alrededor de 1.2 ångströms o 1.2 × 10-10 m de tamaño.
Cuando esta «revolución de la resolución» comenzó a arrasar con la crio-EM, alrededor de 2013, los científicos acudieron en masa al método. Hasta ahora, los investigadores lo han utilizado para resolver las estructuras de más de 10.000 moléculas biológicas. Esto ha sido de interés, porque muchas de ellas son importantes para comprender las enfermedades y desarrollar fármacos.
Imágenes replicadas en instantáneas
Sus primeros defensores buscaron una técnica que pudiera ver las moléculas biológicas no solo con gran detalle, sino también cómo mirarían dentro de las células. Al igual que la crio-EM, la crio-ET requiere un microscopio electrónico. Y se basa en un método de preparación de muestras conocido como vitrificación. Esto es, el enfriamiento rápido del agua alrededor de una muestra para que se congele en un estado similar al vidrio, en lugar de cristales de hielo. Sin embargo, a diferencia de la crio-EM convencional, que requiere muestras purificadas, los investigadores pueden utilizar la crio-ET para capturar estas moléculas in situ.
Con cryo-EM, los científicos crean una imagen en 3D tomando fotografías en 2D de muchas moléculas aisladas en diferentes configuraciones y fusionando los resultados. Con las técnicas de microscopía células cryo-ET, por el contrario, toman múltiples instantáneas de un solo trozo de material. Repleto de moléculas, desde muchos ángulos diferentes, lo que permite que el entorno se mantenga intacto.
Es como tener una foto de toda una multitud, en lugar de la foto de una persona en la cabeza. Por eso Wolfgang Baumeister, biofísico del Instituto Max Planck de Bioquímica en Martinsried, Alemania, y sus colegas la han denominado “sociología molecular”.
Y así es como viven las proteínas, después de todo. “Las proteínas son sociales: en un momento dado, una proteína está en un complejo con unas diez proteínas más”, dice Villa. Después de ver tales interacciones con crio-ET, «no podía soportar la idea de estudiar otra proteína de forma aislada», agrega.
La tomografía electrónica en sí, el uso de un microscopio electrónico para obtener imágenes de una muestra desde varios ángulos, ha existido desde la década de 1960. Pero no fue hasta la década de 1990 que el método comenzó a cobrar sentido.
Técnica para dar con enfermedades y fármacos
Uno de los desafíos fue que las corrientes de electrones son dañinas para las muestras biológicas, lo que dificulta la captura de suficientes instantáneas para obtener una imagen clara y nítida.
Los científicos han mejorado sus imágenes utilizando los últimos procesos de corte de muestras y métodos computacionales. Por ejemplo, una técnica llamada fresado con haz de iones enfocado en crio (crio-FIB) puede cortar muestras en rebanadas delgadas conocidas como laminillas. Aún así, el costo y la experiencia técnica necesarios para usar la técnica de microscopía de células crio-ET, pueden ser prohibitivos para muchos laboratorios, dice Baumeister.
Las primeras demostraciones de crio-ET del grupo de Baumeister incluyeron instantáneas1 de las células de Dictyostelium. Una ameba devoradora de bacterias que vive en el suelo. El equipo reveló, entre otras cosas, características nunca antes vistas de las intrincadas redes de proteínas que componen el citoesqueleto de la ameba. Como la forma en que los filamentos individuales interactúan entre sí y se adhieren a estructuras específicas en las membranas de las células de Dictyostelium.
«Rara vez se pueden asignar funciones biológicas o funciones celulares a una molécula individual», dice Baumeister. «Ahí es donde entra en juego el potencial de descubrimiento de cryo-ET. Independientemente de lo que miremos hoy en día, hay sorpresas».
Villa y su equipo utilizó esta combinación de técnicas para resolver la arquitectura de LRRK2. Una proteína relacionada con formas heredadas de la enfermedad de Parkinson. Su trabajo reveló que la versión mutada de la proteína se adhirió a componentes del citoesqueleto conocidos como microtúbulos, formando una doble hélice a su alrededor. Los hallazgos insinuaron que la LRRK2 mutada podría formar una configuración que promueva este tipo de unión. Lo que podría causar problemas al bloquear moléculas que transportan una carga celular importante a lo largo de los microtúbulos.
Estudios en enfermedades neurogenerativas
Grupos como el de Baumeister han utilizado este método para examinar cómo las proteínas asociadas con enfermedades neurogenerativas interactúan con componentes de la célula como el retículo endoplásmico (RE). Una gran pieza de maquinaria celular que ayuda a sintetizar proteínas. En enfermedades como la de Huntington y la enfermedad de la motoneurona (esclerosis lateral amiotrófica o ELA).
Los investigadores han descubierto que los grupos neurotóxicos de proteínas implicadas en estas enfermedades se comportan de manera muy diferente entre sí dentro de las células. En Huntington, por ejemplo, los agregados de una forma mutante de una proteína llamada huntingtina parecen desorganizar la organización del RE. Mientras que en la ELA, los agregados de una proteína anormal alteran la bioquímica de la célula al activar su maquinaria de degradación de proteínas.
En el futuro, los científicos esperan utilizar estos métodos para comprender mejor cómo funciona la terapéutica. Visualizando cómo actúan los fármacos en las entrañas moleculares de las células. En una demostración temprana, Julia Mahamid del Laboratorio Europeo de Biología Molecular en Heidelberg, Alemania, y sus colegas pudieron vislumbrar antibióticos en una célula bacteriana que se une a los ribosomas. Orgánulos que sirven como fábricas de proteínas. La hazaña fue posible al impulsar la resolución de técnicas de microscopía en células cryo-ET a 3,5 ångströms.
«Creo que ese es probablemente el estado del arte de lo que es posible [con cryo-ET]», dice Kukulski, que no participó en este trabajo. Sin embargo, señala que el ribosoma es omnipresente en la célula y ya está bien caracterizado, lo que facilita su reconocimiento y estudio. Intentar obtener imágenes de estructuras celulares poco conocidas o raras sigue siendo una tarea increíblemente difícil, agrega.
Nuevos desafíos para la ciencia
Cryo-ET es un campo de rápido crecimiento, pero estas técnicas de microscopía e células todavía tiene una serie de limitaciones. La resolución sigue siendo un problema. Aunque el nivel de detalle ha mejorado drásticamente en los últimos años, cryo-ET no puede alcanzar la resolución a nivel atómico de cryo-EM. “Cryo-ET es donde estaba cryo-EM a principios de los 90, mucho antes de que pudiera lograr una resolución atómica”, dice Hong Zhou, biofísico de la Universidad de California en Los Ángeles.
Baumeister cree que, al igual que la crio-EM, la crio-ET eventualmente permitirá a los científicos ver las moléculas biológicas en detalle atómico. Hasta entonces, los científicos continúan investigando con entusiasmo qué conocimientos sobre la célula podrían ser revelados por cryo-ET y otros métodos similares. Debido a que estas herramientas pueden revelar estructuras que nunca antes se habían visto, los investigadores a menudo se quedan con nuevos misterios por resolver. “Lo que me encanta de la tomografía”, dice Villa, “es que siempre generamos más preguntas que respuestas”.
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